ii.识别位点两侧碱基组成与排列方式ღ★◈ღ，同一DNA分子中不一样识别位点酶切速度可相差10倍（如λ中EcoRI位点）

　　iii.反应缓冲液ღ★◈ღ：常见三种关键缓冲液ღ★◈ღ，即高（H）ღ★◈ღ，中（M）ღ★◈ღ，低（L）盐缓冲液ღ★◈ღ，不一样温度下pH值

　　双酶切和多酶切反应同时酶切和分别酶切白石瞳ღ★◈ღ。前者要求两种酶使用缓冲液和反应温度必须相同ღ★◈ღ，即使相同时ღ★◈ღ，一旦发生个别酶切反应ღ★◈ღ，便无法判断是何种酶造成ღ★◈ღ，所以最好采取后者--分别酶切ღ★◈ღ。

　　ii)采取低浓度盐缓冲液限制酶切电泳检验采取高浓度盐缓冲液限制酶切白石瞳ღ★◈ღ。操作简单ღ★◈ღ，但要分先后ღ★◈ღ。假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区）ღ★◈ღ，首先考虑则是相互间酶切是否有影响ღ★◈ღ，两种酶切次序不一样时ღ★◈ღ，其结果大不相同白石瞳ღ★◈ღ。

　　1）单酶切作图法一长度为5Kb线状DNA分子用两种限制酶完全酶切凝胶电泳结果和各位点可能性排列尊龙官方ღ★◈ღ。ღ★◈ღ。要确定其位置ღ★◈ღ，可采取下述辅助方法之一ღ★◈ღ。

　　i.单酶个别酶切ღ★◈ღ：个别酶切时ღ★◈ღ，各种可能性均存在ღ★◈ღ，但只有相邻两个DNA片段才有可能出现在凝胶上ღ★◈ღ。基因工程原理第4页ii.末端标识完全酶切

　　双酶切作图法单酶切结果只能确定一个酶位点ღ★◈ღ，要将两种单酶切结果画在一张图上时则不行基因工程原理第5页分别作图时ღ★◈ღ，同一个酶两种作图法都是正确ღ★◈ღ，但看成在一张图上时ღ★◈ღ，上述两种可能性中只有一个是正确ღ★◈ღ，所以必须进行双酶切反应ღ★◈ღ，其结果见图依据上述原理和步骤ღ★◈ღ，前述5Kb片段酶I与酶II定位结果可用两种方法之一ღ★◈ღ：

　　ii)单酶切第二种酶切凝胶电泳*假如要同时将两种限制酶定位在一条DNA上时ღ★◈ღ，单酶完全酶切作图就没必要了ღ★◈ღ。

　　DNA片段末端标识酶1切分离带标识DNA片段酶2个别酶切电泳EtBr染色摄影放射自显影结果单端标识方法:

　　3.末端标识双相作图法方法2仍存在两个不足之处ღ★◈ღ：①酶1选择不能靠近DNA中央ღ★◈ღ；②需先分离DNA片段ღ★◈ღ，该法可克服上述缺点ღ★◈ღ。现假设有一片段长10Kbღ★◈ღ，其中RE1有三个切点ღ★◈ღ，RE2有一个切点ღ★◈ღ，其图谱可能是:基因工程原理第10页4.Bal31次序酶解作图法

　　DNA片段Bal31处理不一样时间取样终止反应限制酶切凝胶电泳染色观察结果5.切口移位作图法(可检测出100bp片段)

　　稀有识别序列内切酶I型内含子内切酶(真菌细胞核和线噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体)ღ★◈ღ；酵母HO内切酶ღ★◈ღ；大肠杆菌recA

　　即使这些内切酶识别序列都很长ღ★◈ღ：10-19bpღ★◈ღ，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少ღ★◈ღ，因而极少使用基因工程原理第12页

　　II型限制酶人基因组有45,000个CpG岛,一个长度约为1.5kb富含GCDNA片段,其中只有25%CpG岛未被甲基化,这些CpG岛常位于基因5’-端,未被甲基化CpG岛平均长约270kb

　　可用于大尺度限制酶作图限制酶含有以下特征ღ★◈ღ：识别8或6bp序列ღ★◈ღ；富含或只含GC序列ღ★◈ღ；含有CpG序列

　　限制酶图谱无须依赖表型改变,酶谱改变一定是基因型发生了改变,但不一定发生了表型改变,即表型改变不一定会造成酶谱改变.1)

　　插入突变体检测:某DNA片段消失,代之以一较大DNA片段.基因工程原理第14页缺失和插入突变体检测（I）III点突变检测（II）基因工程原理第15页3）点突变检测:某DNA片段消失,代之以两较小DNA片段.前者长度等于后二者长度之和(位点增加)ღ★◈ღ；某两DNA片段消失,代之以一较大DNA片段ღ★◈ღ，前者长度之和等于后者长度(位点消失).

　　重组频率测定同一染色体座位上等位基因可能含有不一样表型,从而组成遗传多型性.等位基因限制酶谱也可能含有多型性,这就是限制酶片段长度多型性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)不一样个体总DNA限制酶完全酶切Southern印迹杂交结果分析基因工程原理第16页

　　当不一样个体交配时,除自由组合外,也可发生重组,如不一样果蝇交配时,其后代表型和限制酶谱可为:表型红:白=1:1,限制酶谱30%个体已发生了重组.4.

　　遗传疾病诊疗分析正常人与遗传病患者一些DNA片段限制酶谱,便可发觉其差异,并总结出各种遗传疾病限制酶长度多态性图ღ★◈ღ。临床诊疗时ღ★◈ღ，将遗传病可疑患者限制酶谱与之比较,便可判断其是否患有此病.基因工程原理第17页第五节DNA连接

　　基因工程原理第18页一.DNA连接方法两种不一样DNA分子能够经过下述方法之一进行连接,而方法选取则是依据其二者末端DNA结构.1.直接连结法该法适合用于:1)

　　重组DNA可用同种酶再切开,但识别简并序列限制酶除外(如AraI)2)不一样种限制酶作用不一样DNA片段产生相容性末端

　　i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重组DNA分子可为其中一个酶所作用,但为另一个酶作用可能性较小,如MboI/BamHI3)PCR产物与特定载体连接

　　4)限制酶和其它方式产生平整末端.基因工程原理第19页2.人工接头连接法1)人工接头（linker）结构

　　i.平整末端连接(各种结构DNA末端均可经过修饰变成平整末端)2X5-CCGGAATTCCGG-3退火基因工程原理第20页ii.产生新克隆位点

　　人工接头连接法适合于那些只有一个DNA片段需加人工接头就能够与另一DNA分子相连DNA分子.利用人工接头也可使任意两个平端DNA分子相连.这种直接相连方法简便,快速,但最终连接起来DNA可能含有不一样结构.为防止这些结构产生,可先使一个DNA先加上人工接头后,再与另一个DNA分子相连.基因工程原理第21页3.匹配接头连接法人工接头即使可连接两个具不一样末端DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时试验不允许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不一样末端DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

　　iii.单链匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾连接法在两个不一样DNA分子末端各加上一个可互补同聚物,即AT或GC.5.连接方法选择方法选择依据:1)两DNA分子末端结构

　　3)是否需要回收DNA片段基因工程原理第23页连接方式选择载体末端外源DNA末端常规连接脱磷酸化同聚物平端连接补齐,人工接头

　　平端平端不能可能可能第一选择可能平端3’-或5’-突起不能不能第一选择不能第二选择基因工程原理第24页二.DNA连接反应

　　一个DNA分子靠近同一分子另一端有效浓度j,该值与DNA长度成反比,即DNA分子越大,该分子两末端越不易相互作用(即本身环化)3)

　　一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增DNA序列有所了解ღ★◈ღ，最少要对其两侧核苷酸序列为已知ღ★◈ღ，方便合成寡核苷酸引物

　　2)基础操作待扩增DNA片段+dNTP+Tris·HCl缓冲液+两引物90℃变性30″50℃退火30″加入TaqDNA聚合酶75℃1′进入第二次循环25-30次循环基因工程原理第28页PCR原理示意图基因工程原理第29页2.PCR产物判定

　　OR分析对于PCR产物限制酶位点上发生了点突变检测极其有用基因工程原理第30页PCR产物OR判定基因工程原理第31页3)分子杂交适合于检测PCR产物非限制酶位点上碱基突变ღ★◈ღ。它是利用两条引物链间特异性DNA片段作探针(常为人工合成一段低聚核苷酸ღ★◈ღ，约20n.t.).当这种探针核苷酸序列与待测DNA核苷酸序列完全互补时才能杂交ღ★◈ღ。假如利用各种等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specificOligonucleotide,ASO）与PCR产物进行杂交ღ★◈ღ，可检测出PCR产物碱基突变ღ★◈ღ。可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析基因工程原理第32页4)核苷酸序列分析

　　DNA扩增产物变性与末端标识扩增引物或定序引物退火双脱氧核苷酸链终止反应ღ★◈ღ，测定DNA序列基因工程原理第33页二．TaqDNA聚合酶特点

　　TaqDNA聚合酶是从一个极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得ღ★◈ღ。该酶分子量为63-68kD

　　1.无磷酸单酯酶临床病学ღ★◈ღ，ღ★◈ღ、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性ღ★◈ღ，无内切酶活性尊龙凯时·(中国)人生就是搏!ღ★◈ღ。ღ★◈ღ，但含有依赖于聚合酶活性5’3’外切酶活性

　　5.具良好热稳定性ღ★◈ღ：在90℃下连续反应30分钟仍有70%酶活基因工程原理第34页TaqDNA聚合酶特征基因工程原理第35页当采取TaqDNA聚合酶进行DNA体外扩增时ღ★◈ღ，必须考虑到以下五个参数ღ★◈ღ：

　　1）热稳定性ღ★◈ღ：在PCR循环中DNA变性时间常为30-60″ღ★◈ღ，若循环30次ღ★◈ღ，其累计加热变性时间为15-30′ღ★◈ღ。TaqDNA聚合酶在90℃下保温30′仍含有70%酶活性ღ★◈ღ，可大大降低操作步骤ღ★◈ღ，易于实现自动化*2）模板与引物特异性ღ★◈ღ：当退火温度和DNA链延伸时温度偏低时ღ★◈ღ，引物与模板配正确特异性大大降低ღ★◈ღ，从而造成一些不需要DNA片段被扩增ღ★◈ღ。显然ღ★◈ღ，其产物专一性大大降低白石瞳ღ★◈ღ，使结果无法分析ღ★◈ღ。因为TaqDNA聚合酶最适反应温度为80℃ღ★◈ღ，退火温度可提升到55℃以上ღ★◈ღ，由此大大降低了引物与模板非专一性结合ღ★◈ღ，使产物均一性大大增加**3）合成产率ღ★◈ღ：反应底物和产物在DNA扩增中不停发生改变ღ★◈ღ，最终将会造成聚合反应进入平台期ღ★◈ღ，平台期出现时间与聚合酶特征相关ღ★◈ღ。研究表明ღ★◈ღ，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期ღ★◈ღ，累积产物拷贝数为2×105凯时尊龙官网appღ★◈ღ。ღ★◈ღ，当采取TaqDNA聚合酶时ღ★◈ღ，扩增25次后才进入平台期ღ★◈ღ，拷贝数可大4×106***4）延伸长度ღ★◈ღ：有时为了获取较长DNA片段扩增ღ★◈ღ，这就要求DNA聚合酶含有较强延伸能力白石瞳尊龙凯时官方ღ★◈ღ。当扩增片段大于250bp时ღ★◈ღ，Klenow片段和T4聚合酶扩增产率大大降低ღ★◈ღ。利用T7DNA聚合酶ღ★◈ღ，可使扩增片段达2Kbღ★◈ღ。当利用TaqDNA聚合酶时ღ★◈ღ，最长延伸长度为4.4Kb.基因工程原理第36页

　　经改造TaqDNA聚合酶可扩增出40kbDNA片段.5）扩增产物可靠性ღ★◈ღ：评定DNA聚合酶一个主要指标是它复制DNA可靠性尊龙凯时官方ღ★◈ღ，即掺入错误碱基频率ღ★◈ღ。这对于PCR技术可靠性是至关主要ღ★◈ღ。Klenow片段错误掺入率为10-4尊龙凯时官方ღ★◈ღ，TaqDNA聚合酶错误掺入率为5×10-3

　　*注ღ★◈ღ：1）退火温度常与引物长度和碱基组成有直接相关关系ღ★◈ღ，引物越长或GC含量较高ღ★◈ღ，退火温度能够高些ღ★◈ღ，反之则低些ღ★◈ღ。退火温度越高ღ★◈ღ，引物与模板（即扩增DNA）结合特异性越高ღ★◈ღ，这可大大降低非特异性DNA片段扩增ღ★◈ღ。引物长度常为20-28聚体ღ★◈ღ，其中有50%以上GC含量ღ★◈ღ，无本身互补序列ღ★◈ღ，尤其是3末端不应有内部二级结构尊龙登录入口ღ★◈ღ。ღ★◈ღ，引物加量为每100μll20pmol.**2)出现平台期原因可能有ღ★◈ღ：①后期循环酶浓度或聚合时间不足ღ★◈ღ；②引物耗尽ღ★◈ღ；③dNTP耗尽ღ★◈ღ；④产物浓度过高白石瞳ღ★◈ღ，以致ds-DNA解链后又快速退火ღ★◈ღ，不能与引物结合ღ★◈ღ。***3）链延伸长度与延伸时间相关ღ★◈ღ，对于TaqDNA聚合酶ღ★◈ღ，每分钟可形成n.t.或更多ღ★◈ღ。假如要扩增3-4KbDNAღ★◈ღ，在72℃下需将酶延伸时间增至3-4分钟ღ★◈ღ。基因工程原理第37页三．PCR方法

　　该法可用于核苷酸序列测定,DNA足迹分析技术和测定甲基化作用基因工程原理第39页5.不对称PCR(AsymmetricalPCR)采取不一样引物浓度比率ღ★◈ღ，如50ღ★◈ღ：1ღ★◈ღ，100ღ★◈ღ：1ღ★◈ღ，可得大量拷贝ssDNA用于测序6.GC串PCR(GCclampPCR)应用变性剂梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)可检测出DNA片段中一对碱基改变ღ★◈ღ，在DNA分子一端加上一GC串（约40n.t.）利用它高解链温度特征ღ★◈ღ，在梯度变性胶上可检测出原DNA链中最高解链区内点突变基因工程原理第40页

　　有一个碱基改变两种引物在较宽松复性条件下竞争DNA模板ღ★◈ღ，其中只有完全互补引物才能大量配对ღ★◈ღ。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换尊龙凯时官方ღ★◈ღ。基因工程原理第41页8.等位基因专一PCR(AllelespecificPCR,ASPCR)

　　利用该法可在一已知DNA序列中引发点突变ღ★◈ღ，缺失突变和插入突变ღ★◈ღ。基因工程原理第44页13.重组PCR(RecombinantPCR)

　　竞争PCR法(加入已知量标准物)ღ★◈ღ；RT-PCR-转录法基因工程原理第46页基因工程原理第47页五．PCR技术应用

　　1.遗传疾病诊疗人类镰刀型贫血症是因第六个密码子第二个字母发生了A→T改变ღ★◈ღ，从而造成该位点谷氨酸为缬氨酸所取代白石瞳ღ★◈ღ。A→T突变还造成限制酶OxaNI位点消失ღ★◈ღ。利用PCR技术和限制酶谱分析诊疗此分子疾病大致过程以下ღ★◈ღ：

　　DNA扩增PAGE染色观察比较不一样个体结果限制酶切PAGE染色观察此法可在3-4h取得结果尊龙凯时官方ღ★◈ღ，比常规Southern杂交法简便ღ★◈ღ、快速ღ★◈ღ。基因工程原理第48页2.传染病诊疗假如已知某种病原菌(体)中特异性DNA片段核苷酸序列ღ★◈ღ，这个片段就能够用于DNA扩增ღ★◈ღ，并利用DNA杂交或凝胶电泳方法诊疗病原体存在是否ღ★◈ღ。比如AIDS诊疗ღ★◈ღ，常规方法是利用血清背景和病毒培养尊龙凯时官方ღ★◈ღ，往往需要3-4个星期ღ★◈ღ，采取PCR技术则只需一天左右ღ★◈ღ，且准确率高3.基因快速克隆依据已知基因序列设计PCR引物,可直接在不一样样品中进行PCR扩增,而无须分离纯化生物样品4.基因突变

　　1. 本站所有资源如无特殊说明ღ★◈ღ，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器ღ★◈ღ。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压ღ★◈ღ。

　　2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等白石瞳ღ★◈ღ，如果需要附件ღ★◈ღ，请联系上传者ღ★◈ღ。文件的所有权益归上传用户所有ღ★◈ღ。

　　5. 人人文库网仅提供信息存储空间ღ★◈ღ，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理ღ★◈ღ，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑ღ★◈ღ，并不能对任何下载内容负责ღ★◈ღ。

　　7. 本站不保证下载资源的准确性尊龙凯时官方ღ★◈ღ、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失ღ★◈ღ。

　　第6课 工业化国家的社会变化 教学设计-2023-2024学年浙江省部编版历史与社会九年级下册